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　　糠醛又稱呋喃甲醛，是重要的雜環類有機化合物。糠醛類化合物已經在白酒、葡萄酒、黃酒中檢測到。在白酒中，醬香型白酒的糠醛含量最高。在白酒生產中，原料玉米、高粱、稻殼等含有的多縮戊糖在低pH值下在蒸餾過程中水解為戊醛糖，戊醛糖進一步脫水環化生成糠醛。研究發現，糠醛對酵母菌的生長具有一定的抑制作用，影響原料出酒率。

　　研究結果表明，醬香型白酒在蒸餾過程中產生的大量糠醛，并沒有完全蒸餾至酒中，在酒醅中有著較高的殘留。在醬香型白酒酒醅堆積過程中，糠醛含量大量減少，堆積后，糠醛的含量降低，有的可以降解至出池酒醅的水平。不少研究表明，微生物可以利用糠醛發酵產生糠醇。因此，研究醬香型白酒堆積過程糠醛降解微生物，對進一步明晰醬香型白酒的堆積機理，縮短堆積時間，提高醬香型白酒的出酒率具有重要意義。

　　1材料與方法

　　1.1材料與設備

　　酒醅  某白酒廠堆積6d的醬香型酒醅，取樣后于－20℃保存； 糠醛、糠醇、2—辛醇，色譜純；糠醛、氯化鈉、氯化芐，分析純； 限制性內切酶、Taq DNA Po lym erase、dNTP（25mmo l/L）、ITS 引物。
    　

　　氣相色譜質譜聯用儀( GC 6890—5975 MSD ) ；PCR 儀( PC300 )  EppendorfM aster persona；l電泳儀、凝膠成像儀 B IO—RAD；冷凍高速離心機3K 15 美國Sigma—A ldrich公司； 掃描電子顯微鏡  FE IQuanta 200。

　　1.2 培養基及培養條件

　　1.2.1  平板分離培養基

　　以糠醛為唯一碳源的培養基：糠醛5g，KNO3 10g，N aCl 5g，瓊脂20g，加去離子水至1000mL，調節pH 到5.5，于121℃濕熱滅菌30min。

　　1.2.2  搖瓶培養基 酒醅浸提液：50g 酒醅中加入100mL離子水，超聲30min，離心后抽濾，共收集3次。在酒醅浸提液中添加適量糠醛，搖瓶培養糠醛降解菌。

　　1.3 實驗方法

　　1.3.1 菌種分離 

　　在滅菌后的三角瓶中盛入適量酒醅，添加去離子水，用玻璃珠打散后浸泡過夜，三角瓶口覆蓋有紗布。將酒醅浸泡液梯度稀釋涂布于分離平板上，置于37℃培養箱中。

    　1.3.2 菌種鑒定 

　　采用氯化芐抽提真菌DNA：培養液離心抽濾后，收集菌絲體，轉入5mL離心管中，加入0.7mL 提取液（100mmo l/L Tris—HCl， pH9.0；40mmol /L EDTA，pH 8.0），1mL 10% SDS，1.5mL 氯化芐，劇烈振蕩使其成乳狀，50℃保溫1h。加入1.2mL 3mmol/L的NaAc，冰浴15min，6000r/min離心15min，取上清液。加入等體積的異丙醇， 0.1倍體積的0.3mol/L NaAc，10000r/m in 離心10min，棄上清液，再加入200uLTE 溶解，文章來源華夏酒報100uL苯酚，100uL氯仿抽提，混合均勻，在12000r/m in 下離心5m in。取上清液于另一1.5mL 離心管中，進行酚—仿抽提2次—3次。加入上清液等體積的異戊醇，在12000 r/min下離心5min。取上清液于另一1.5mL 離心管中，加入2.5倍— 3倍體積的無水乙醇，放入冰浴30min，于16000r /m in下離心2m in，棄上清液，用70% (v/v)100uL乙醇沉淀，16000r/min下離心2min。去上清液，倒置至干，加40uLTE 于－20℃中放置過夜，0.8% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

    　采用通用引物ITS1和ITS4擴增整個ITS序列，把所得的ITSrDNA序列提交到GenBank數據庫，利用Blasta工具進行序列比對，對目的菌株進行鑒定。

    　1.3.3  色譜條件

　　用Agilent GC 6890—5975MSD對樣品進行鑒定，通過DB—Wax毛細管柱進行分離。

    　程序升溫條件為50℃保持2min，然后10℃/min升溫至230℃，保持1min。進樣口溫度為250℃，載氣為高純度He；流速為2mL/min。分離后的樣品用Agilent 5975MSD鑒定。質譜條件：E I電離源；電子能量：70eV；離子源溫度：230℃；掃描范圍：35amu—350amu。

    　1.3.4  標準曲線的繪制

　　以酒醅浸提液作為標準品配制。取合適濃度的糠醛、糠醇的標樣，添加到適量酒醅浸提液中。以2—辛醇為內標，使用二氯甲烷進行微萃取。萃取相通過GC—MS 分析，制作標準曲線。

    　1.3.5  糠醛及糠醇的定量　

　　通過檢出物質譜圖和N IST05a.L Database中標準譜圖的比對，以及通過添加標準品進行驗證。以2—辛醇為內標，經過GC—MS檢測后，將待測物質和內標的相對峰面積比代入相對應的標準曲線方程，計算出待測物質在酒醅浸提液中的含量。

　　2 結果與分析

　　
    　2.1 菌株的篩選

    　在以糠醛為唯一碳源的分離培養基平板上進行篩選，經過分離、純化，從酒醅樣品中分離出了一株霉菌，將該菌株接種于添加了一定量糠醛的酒醅浸提液中搖瓶培養，發現菌株繁殖生長速度較快。通過對酒醅浸提液的成分檢測，發現糠醛含量隨著菌株的大量繁殖而迅速減少，且糠醇含量增多。

    　2.2 分離菌株的鑒定

    　2.2.1 菌株的ITS rDNA 測序結果 將利用氯化芐抽提基因組的方法進行測序。
    　掃描電鏡下，其分生孢子長橢圓形，呈長鏈著生， 斷開后兩端平載，結果基本符合宛氏擬青霉分生孢子的特征。

    　2.2.２ 菌株的鑒定　

　　將利用氯化芐抽提基因組方法所得的ITSrDNA序列提交到GenBank 數據庫，利用Blasta工具進行序列比對，對目的菌株進行鑒定。

　　鑒定結果為宛氏擬青霉Paecilomyces variotii。該菌株在泥土、室內環境、植物、動物和食品中普遍存在。它是一個耐熱真菌，繁殖速度快，且能夠在低氧以及存在防腐劑的環境中生長。

　　目前， 國內外學者在降解糠醛菌種的馴化和篩選方面進行了大量研究。

3 結論 

　　本實驗從醬香型白酒酒醅中篩選出了一株高效降解糠醛的菌株，利用氯化芐抽提基因組的方法可以有效地鑒定出該菌株為宛氏擬青霉。

　　通過對降解過程的底物糠醛及產物糠醇的定量分析可以發現，該菌株降解糠醛速度快，為高效降解糠醛菌。宛氏擬青霉對酒醅中糠醛降解為糠醇有較大影響，從而證明了降解糠醛過程中微生物的作用。